Исследование ставит под сомнение стерильность ядов змей и пауков

В течение многих лет исследователи искали в ядах животных антибиотики нового поколения. Это связано с тем, что эти химические коктейли обладают мощной антимикробной активностью в дополнение к опасной физиологической - что также привело к распространенному представлению о том, что, несмотря на связь с внешним миром, ядовитые железы являются стерильной средой.

Новое исследование проводилось под руководством РНК - биолога Университета Нортумбрии Стергиоса Мошоса и венолога Стива Трима, основателя биотехнологической компании Venomtech, целью которой является разработка исследовательских инструментов и фармацевтических препаратов на основе яда. В работе представлены генетические и культуральные доказательства того, что бактерии не только живут в ядах нескольких видов пауков и змей, но и активно адаптируются к среде ядовитых желез, что может иметь значение для эволюции ядов и клинического лечения укусов.

Черношейная плюющаяся кобра(Naja nigricollis) - один из изученных видов - из Ватаму, Кения

Отказ от стерильной догмы
Идея о том, что яды животных не содержат микробов, вероятно, возникла где-то в середине 20 века, когда исследователи начали документировать противомикробную активность ядов и их компонентов. Эти лабораторные исследования были затем перенесены в клиническую практику, так как и по сей день укусы змей часто не лечат, чтобы предотвратить заражение.

Однако, Себастьен Ларреше, клинический микробиолог из госпиталя Инструктажа вооруженных сил Бегин(Франция), указывает в своем электронном письме в The Scientist, что "новые бескультуральные методы позволяют предположить, что ни одна анатомическая область у человека не является действительно стерильной. Поэтому, экстраполируя, мы можем предположить, что ядовитый аппарат имеет свою собственную микробиоту". Действительно, исследования обнаружили микробы в ядовитых железах кальмаров, улиток и других животных, хотя исследования микробиома ядовитых желез в настоящее время немногочисленны, отмечается в статье Toxicon: X в соавторстве с Тримом и Мошосом.

Увидев пробел в литературе, Мошос, Трим и их коллеги в новом исследовании использовали как культуральные, так и бескультуральные методы для поиска микробов в ядах пяти видов змей и двух видов пауков. Для сравнения они также взяли мазки изо рта и клыков животных. Они получили бактериальные 16S-последовательности из всех образцов и культивируемые микробы из большинства из них, хотя культивируемые виды составляли лишь малую часть того, что было обнаружено с помощью ДНК. Микробы, обнаруженные в образцах яда, заметно отличались от общей флоры ротовой полости для каждого вида, причем около 20 процентов микробов, обнаруженных в образцах яда, не встречались во рту. Кроме того, авторы обнаружили, что некоторые из культивируемых микроорганизмов - например, штаммы Enterococcus faecalis - размножаются в яде черношейной плюющей кобры(Naja nigricollis), вероятно, благодаря мутациям в генах, связанных с целостностью мембран.

Предполагаемые микробы яда, которые удалось вырастить команде, оказались удивительно устойчивыми к токсинам животных. "Обычно вы добавляете 15 миллиграммов на миллилитр любого противомикробного вещества в среду роста, и интересующая вас бактерия не только не вырастет, но и вообще ничего не вырастет", - объясняет Мошос. "В данном случае наши бактерии росли вполне благополучно в этой и более высоких концентрациях яда. Их рост не был подавлен вообще". В статье отмечается, что один штамм не проявил никаких негативных последствий воздействия яда даже при концентрации белка яда 50 мг/мл, в то время как устойчивый к ванкомицину клинический изолят того же вида был уничтожен примерно в одну пятую от этого количества.

Ларреше, который не участвовал в исследовании, называет микробиологические методы, использованные командой, "надежными", отмечая при этом, что "остается риск заражения бактериями, присутствующими на клыках при выбросе яда". Он признает, что этот риск трудно устранить, поскольку "трудно(и, прежде всего, опасно для оператора и для змеи) тщательно дезинфицировать клыки перед отбором проб".

Гонка вооружений или функция?
Мошос и Трим говорят, что эти бактерии, вероятно, так долго оставались незамеченными, несмотря на обширные исследования ядов змей и пауков, из-за того, как эти яды обычно готовятся. Вскоре после сбора большинство ядов подвергаются лиофилизации - своего рода сублимационной сушке, чтобы продлить срок их хранения. Но этот процесс уничтожает любые живые бактерии, поэтому культуральные методы обнаружения микробов не подходят. Остаются методы на основе ДНК, которые также оказываются сложными из-за наличия в яде ферментов и других химических веществ, которые могут мешать ПЦР.

По словам команды, одной из главных проблем исследования было выяснение того, как извлечь ДНК из яда. "Я никогда не видел ничего подобного", - говорит Мошос, чьи исследования в основном сосредоточены на получении генетического материала из сложных образцов, таких как выдыхаемый воздух. "Нам пришлось немного повозиться", - говорит он, чтобы заставить протоколы извлечения работать.

Мошос и Трим надеются, что другие исследователи возьмут их методы и опробуют их на других видах ядовитых животных. По их мнению, в используемых ими видах нет ничего особенного; просто микробы способны эволюционировать и жить где угодно, даже в железах, вырабатывающих яды с высоким антимикробным действием. Теперь они и их коллеги хотят знать: Откуда берутся бактерии и что они там делают?

Бактерии, скорее всего, являются условно-патогенными, предполагают Мошос и Трим. По выражению Джона Данбара, биолога Национального университета Ирландии(Голуэй), который не участвовал в работе, яд - это "идеальный питательный бульон" благодаря наличию в нем всех белков и других биомолекул. Все, что нужно сделать микробу, чтобы воспользоваться этим ресурсом, - это выжить.
Трим говорит, что возможность пребывания бактерий может быть причиной того, что антимикробные препараты находятся в яде в первую очередь - чтобы гарантировать, что его биохимический состав остается достаточно мощным для охоты или защиты от хищников в течение дней, недель или даже месяцев, пока он хранится в железах до использования.
"Если бактерии метаболизируют ваш арсенал, вы можете увидеть потенциал для деактивации ядов", - говорит он. Вполне возможно, что между микробами и ядовитыми животными идет гонка вооружений, объясняет Трим. Животные эволюционируют, производя большее количество и более мощные противомикробные препараты, чтобы их токсичный коктейль сохранялся достаточно долго для использования, в то время как микробы развивают способы борьбы с этими соединениями.

В поддержку этой идеи Мошос говорит, что команда обнаружила "статистически значимое обогащение мутаций, которые указывают на то, что бактерии активно развиваются, постоянно пытаясь попасть в яд". Это включало мутации в генах, связанных с устойчивостью к противомикробным препаратам и целостностью мембран, которые могут быть необходимы для того, чтобы противостоять токсинам яда, разрушающим липиды.

Клинические вопросы остаются
Какую бы роль они ни играли в организме ядовитых животных, если бактерии, обитающие в яде, могут инфицировать кожу и другие ткани, они могут нанести прямой вред укушенным существам, включая человека. Мошос подозревает, что бактерии, обитающие в яде, особенно патогенны. "В тот момент, когда яд попадает в ткань, происходит массовый лизис, массовая гибель клеток хозяина - это создает суп из питательных веществ, которым бактерии очень рады. В ране от змеиного укуса они могут сидеть и просто питаться, жить, размножаться, расти".

"Подавление ядом внезапно снимается, и они могут свободно переходить к полному экспоненциальному росту", - добавляет Трим. Действительно, обнаружение Мошосом, Тримом и их коллегами Enterococcus faecalis в яде плюющейся кобры особенно интригует, поскольку этот вид известен как виновник многих инфекций, вызываемых укусами змей. Однако исследование не позволило напрямую оценить клиническую значимость этого или любого другого потенциально переносимого ядом микроба.

Данбар говорит, что преобладающее предположение о том, что все инфекции при ядовитых укусах вызываются условно-патогенными микробами, живущими на коже или в окружающей среде, никогда не имело для него смысла, особенно когда речь шла об укусах пауков.
"По роду своей деятельности я порезался и поцарапался, проходя через болота Южной Америки, азиатские джунгли и африканские пустыни, и ни разу не столкнулся с бактериальной инфекцией", - отмечает он, поэтому он скептически относится к тому, что укус "крошечного паука с такими маленькими клыками, что даже не видно прокола" может быть инфицирован микробами, живущими на коже. "Кажется гораздо более правдоподобным, что патогенные и устойчивые к антибиотикам бактерии в яде или на клыках, проникшие через кожные барьеры, с гораздо большей вероятностью будут ответственны за возникновение инфекции".

Данбар и его коллеги исследовали эту идею для укусов ложной вдовы(Steatoda nobilis), обнаружив, что бактерии на клыках пауков отличаются от бактерий на их теле и включают устойчивые к антибиотикам человеческие патогены. Однако в исследовании не изучался яд или ядовитые железы пауков - это исследование находится в стадии разработки, говорит Данбар. Он добавляет, что команда обнаружила, что яд "не оказывает ингибирующего действия на бактерии, что позволяет предположить, что бактерии, которые могут быть перенесены во время укуса, не будут подавлены непосредственно активностью яда".

Ларреше высказывает аналогичные сомнения и говорит, что необходимы дальнейшие исследования на различных видах змей, поскольку "авторы использовали только виды опидий, укусы которых, как известно, являются регулярными источниками инфекций". Он добавляет: "На мой взгляд, было бы уместно добавить в эту группу такие виды, как представители родов гадюк Vipera или Echis, укус которых, напротив, почти никогда не осложняется инфекцией".

На данный момент, по его словам, исследование не изменило его мнения - он по-прежнему считает, что в инфекциях, связанных с укусами, виноваты оппортунистические микробы кожи или окружающей среды, а не микробы, выделяемые ядом.

Мошос, напротив, говорит, что его работа убедила его, утверждая, что это вряд ли совпадение, что самый распространенный микроб в их культурах также является самым распространенным виновником инфекций, вызванных укусами змей. "Если он выглядит как утка и ходит как утка, то это, скорее всего, не курица", - говорит он.